บทที่ ๒ กล้องจุลทรรศน์และวิธีเก็บรักษา

กล้องจุลทรรศน์และการเก็บรักษา

( The Microscope )

กล้องจุลทรรศน์บางแบบมี Fine และ Coarse Adjustment ติดอยู่ด้วยกัน บางแบบก็แยกกัน

ลำกล้อง ( body tube ) อาจจะเป็นลำกล้องตั้งตรง โดยมี Inclination joint หรือกล้องเอน ถ้าลำกล้องของกล้องจุลทรรศน์มีขนาดมาตรฐานยาว ๑๖๐ ม.ม. ตอนบนสวม Ocular ( eye piece ) ตอนล่างยึดติดกับแผ่นโลหะกลม ๆ ที่หมุนรอบตัวได้ ( Revolving nosepiece )

Eyepiece หรือ Ocular เป็นตำแหน่งที่เราจะเห็นภาพประกอบด้วยเลนซ์ ๒ อัน อันบนเป็นเลนซ์เว้า อันล่างเลนซ์นูน ระหว่างเลนซ์ทั้งสองมีแผ่นเหล็กรูปกลมเจาะรูตรงกลาง คั่นกลางไว้ สำหรับเอาหางม้าหรือเส้นผมประมาณ ๕ - ๘ ม.ม. ติดเพื่อให้เครื่องชี้ ( Pointer )

Ocular สวมอยู่ตอนบนของ body tube หมุนได้รอบตัว ขยาย ๑๐ เท่า หรือขนาดต่าง ๆ บางแบบมีสองหัวสำหรับดูทั้งสองข้าง

Revolving nosepiece เป็นโลหะรูปกลมยึดระหว่าง body tube กับ Objective ด้านล่างเป็นรูปเกลียวสำหรับสวม Objective มักจะมี ๑ - ๕ รู

Objective lens ป็นส่วนประกอบที่มีราคาแพงที่สุดของกล้องจุลทรรศน์ ทำหน้าที่ขยายวัตถุ ประกอบด้วยเลนซ์ ตั้งแต่ ๒ อันขึ้นไป มีทั้งเลนซ์นูนและเลนซ์เว้าประกบกันเพื่อให้ขยายภาพได้หลายเท่าและชัดเจน Objective ที่ดีขึ้นอยู่ที่เลนซ์ข้างในเพราะเลนซ์ที่ดีนั้นจะช่วยแก้ภาพจริงที่เกิดขึ้นไม่ให้เบี้ยวและไม่ให้สีรอบ ๆ ภาพด้วย

กำลังขยายของ Objective ที่มีอยู่คือ ๔.๕, ๕, ๑๐, ๔๐, และ ๑๐๐ เท่า

ตามธรรมดาเรามักเรียก Objective อันที่ติดอยู่กับกล้องที่มีกำลังขยายต่ำที่สุดว่า Low power Objective อันกลางว่า medium power Objective และอันมีกำลังขยายสูงที่สุดว่า high power Objective

Objective ที่กล่าวมานี้ใช้อากาศเป็นตัวกลาง ยกเว้นอันที่มีกำลังขยาย ๑๐๐ เท่า ซึ่งจะมีลักษณะ Oil หรือ Oel เขียนบอกไว้ อันนี้ใช้น้ำมันที่มีคุณสมบัติเหมาะเป็นตัวกลาง เวลาจะใช้หัวนี้ โปรดระมัดระวังเป็นพิเศษ

แท่น ( Stage ) ประกอบด้วยแผ่นเหล็กรูปสี่เหลี่ยมจัตุรัส บางชนิดด้านหน้ามนตรงกลางมีช่องสำหรับให้แสงผ่านกระจกสไลด์ ( Slide ) ได้ มีเหล็กสปริง ( Spring Clips ) ๑ คู่ ช่วยในการกดสไลด์ให้อยู่กับที่ กล้องบางแบบอาจมีที่ประกับสไลด์พิเศษ เรียกว่า ( mechamical stage )

เลนซ์รวมแสง ( Condenser ) อยู่ใต้ stage มีเลนซ์รวมแสงอยู่ตรงกลางรับแสงมาจากกระจกของกล้อง หรือโคมพิเศษของกล้องโดยเฉพาะ ( Microscope lamp ) ให้แสงผ่านวัตถุที่ต้องการดูมากที่สุด Condenser ยังประกอบด้วย ( diaphragm ) ที่มีก้านยื่นออกมาบังคับ หรี่ หรือ เปิดให้แสงเข้ามากหรือน้อยตามความต้องการ นอกจากนี้ อาจจะมีกระจกกรองแสงสีฟ้าช่วยตัดแสงให้เย็นตาด้วย ถ้าใช้แสงที่มาจากแหล่งแสง

กระจกเงา ( Mirror ) อยู่ใต้ Condenser มี ๒ หน้า หน้าหนึ่งเป็นกระจกเว้าอีกหน้าหนึ่งเป็นกระจกราบ สำหรับหันหาแสงสว่างของดวงอาทิตย์หรือแหล่งแสงในห้องปฏิบัติการ ยึดติดกับแกนที่หมุนได้รอบตัว ตามปกติให้ใช้ด้านราบหันรับแสงสว่าง นอกจากต้องการความสว่างให้ผ่านเข้ามาก ๆ เพื่อขจัดภาพอื่นที่เข้ามาปะปนในจอภาพ ก็ให้ใช้ทางด้านเว้าและปรับระยะของ Condenser ช่วย

วิธีใช้กล้องจุลทรรศน์

ก. ชนิดใช้ Low and Medium power objective

๑. วางกล้องจุลทรรศน์ในตำแหน่งที่จะหันกระจกรับแสงจากท้องฟ้า หรือดวงไฟ

๒. หมุน objective อันที่มีกำลังขยายที่ต้องการให้เข้าที่หันกระจกรับแสงสว่างเปิด

( Iris diaphragm ) เต็มที่ให้แสงผ่านเข้ามากที่สุด ตามองดูที่ Ocular มือขยับกระจกจนแสงสว่างเข้าสู่จอภาพดี

( ไม่มีภาพอื่นมารบกวน ) หากมีภาพอื่นมารบกวนขยับล้อของ Condenser ขึ้นลง ภาพที่รบกวนจะหายไป ถ้าไม่หายให้กลับหน้ากระจกช่วย

๓. เอาวัตถุที่ต้องการดู ( เอามาน้อยที่สุด ถ้าเป็นของหนา ๆ ต้องทำให้บางเสียก่อน ) วางหรือหยดบนสไลด์ ( coverslip ) ใช้มือหมุน coarse adjustment ให้ objective ๑๐ x จรดลงสู่ object มากที่สุด

๔. ค่อย ๆ หมุน coarse adjustment ขึ้นทีละน้อย ( หมุนล้อใหญ่แบบถอยหลังเข้าหาตัว ) ตอนนี้ตามองที่ Ocular ( หัดมองให้ชินตาทั้งสองตา อย่าหลับเสียข้างหนึ่ง ) จนเห็นภาพของวัตถุปรากฏในจอภาพ ขยับจนเห็นว่าภาพนั้นชัดที่สุดแล้วเปิดหรือหรี่ diaphragm ตามสมควร ปรับให้ชัดที่สุดด้วย fine adjustment

๕. ถ้าต้องการขยายภาพให้โตกว่านี้ ก่อนอื่นต้องเลื่อนกระจกสไลด์ให้ภาพที่ท่านต้องการขยายมาอยู่ตรงกึ่งกลางของจอภาพเสียก่อนแล้วหมุน Revolving nose piece ให้ objective ที่มีกำลังขยายมากกว่าเข้ามาแทนที่ มองดูภาพ จะเห็นมีขนาดโตขึ้นแต่จะไม่ชัดดังตอนแรก ปรับด้วย Fine adjustment จนภาพชัดที่สุด เปิดหรือหรี่ Iris diaphragm จนความสว่างพอดีตามต้องการ

ข้อที่ต้องระวัง ทุกครั้งที่หมุนล้อใหญ่หรือเล็ก เพื่อให้ Objective เลื่อนต่ำลงจะต้องมองดูข้างนอกเสมอ เพื่อป้องกันการเสียหายอันเกิดจากหัว Objective ชนกับสไลด์

วิธีใช้หัว Oil immersion Objective

น้ำมันที่ใช้หยอดมี refractive index เท่ากับ condenser lens และ Front lens ของ Objective

หยด Crown หรือ Cedar wood Oil เล็กน้อย บน Slide ในบริเวณที่จะดู เลื่อนหัว Objective จนกระทั่งลงมาแตะน้ำมันอย่างช้า ๆ โดยหมุน Coarse adjustmen เมื่อแตะส่วนบนของหยดน้ำมันแล้วหยุด วิธีที่ดีที่สุดคือ เลื่อนลงค่อย ๆ ตามองระดับเดียวกันกับ Stage ดูช่วงระหว่าง Objective และ Slide เมื่อหัวกล้องแตะน้ำมัน ต่อไปถ้าจะขยับหัวกล้องต้องใช้ Fine adjustment

ฟองอากาศหรือฝุ่นในน้ำมันจะทำให้ภาพที่เห็นไม่ชัด ฉะนั้นต้องปิดขวดน้ำมันอยู่ตลอดเวลา ถ้าเกิดมีฟองอากาศในน้ำมัน ต้องเช็ดออกแล้วเปลี่ยนน้ำมันใหม่แล้วปรับภาพช้ำอีกที่

ในการใช้ Low Power Objective หรือหัว Oil ต้องระมัดระวัง เช็ดน้ำมันออกจากกระจกหรือ Cover glass โดยใช้กระดาษเช็ดเลนซ์ซับออก หัวกล้องเมื่อใช้แล้วควรเช็ดออกด้วยวิธีเดียวกัน ถ้าน้ำมันแห้งติดเกรอะกรังอยู่ก็เช็ดออกได้โดยใช้กระดาษเช็ดเลนซ์ซุบน้ำยา Xylene สักเล็กน้อยเช็ดออก

การรักษากล้องจุลทรรศน์

นอกจากผู้ใช้จะต้องรู้จักวิธีใช้กล้องให้ถูกวิธีแล้ว ผู้ที่ใช้จำเป็นจะต้องรู้จักวิธีรักษากล้องให้ถูกวิธีด้วย จึงจะได้ชื่อว่าเป็นผู้ที่ใช้กล้องที่ดีได้ กล้องเป็นเครื่องมือที่ต้องใช้ความละเอียดอ่อนในการสร้างจากวัสดุที่มีค่าโดยช่างผู้ชำนาญ ถ้ารักษาดีก็จะคงสภาพเดิมอยู่ตลอดไป แต่โดยนัยตรงกันข้ามถ้าละเลยไม่เอาใจใส่รักษากล้องก็จะชำรุดหรือเสียหายได้ การรักษากล้องโดยเฉพาะส่วนที่เลนซ์ติดอยู่ควรปฏิบัติดังต่อไปนี้

๑. อย่าใช้กล้องหลายมือ ยอมให้ใช้เฉพาะผู้ที่ไว้ใจได้เท่านั้น เวลาจะยกควรจะจับที่แขนของกล้อง และเมื่อเลิกใช้ก็ควรเข้ากล่องเดิม หรือจะใช้ที่คลุมเพื่อป้องกันฝุ่นก็ได้

๒. เลนซ์ของกล้องต้องอยู่ในสภาพสะอาดอยู่เสมอ ถ้ามีฝุ่นละอองเกาะก็ควรจะปัดกวาดโดยใช้แปรงขนอูฐแล้วจึงเช็ดด้วยกระดาษเช็ดเลนซ์อีกครั้งหนึ่ง อย่าลืมว่ากระจกที่ใช้ทำเลนซ์ย่อมบอบบาง มักจะเป็นรอยง่าย ถ้าไม่ปัดเอาฝุ่นออกก่อนเช็ดหรือใช้ผ้าธรรมดาเช็ดโดยตรง ต้องใช้เช็ดด้วยกระดาษเลนซ์

๓. ฝุ่นเกาะบนเลนซ์ของ Eyepiece เมื่อส่องกล้องจะสังเกตเห็นได้ง่ายโดยเป็นจุดหรือดวงเล็ก ๆ ฝุ่นที่เกาะที่ Objectiveจะทำให้ภาพที่เห็นไม่ชัด มองดูคล้าย ๆ กลุ่มหมอก ถ้าเลนซ์ Objective เกิดเปียกขึ้นมา

เพราะเหตุหนึ่งเหตุใด จะต้องทำความสะอาดจนกว่าจะใช้มองได้ชัด Eyepiece ควรจะติดอยู่กับตัวกล้องเสมอโดยสวมติดกับ Draw tube ทั้งนี้เพื่อป้องกันมิให้ฝุ่นเข้าท่อซึ่งจะทำให้หัวเลนซ์ ส่วนในของ Objective

หรือแก้วสะท้อนภาพมีฝุ่นเกาะได้ ถ้าเกิดมีฝุ่นเกาะบนชิ้นส่วนดังกล่าวให้ทำความสะอาดโดยใช้แปรงขนอูฐปัดออก หรือใช้วิธีเป่าฝุ่นให้หลุดออกไปนั้น ขอแนะนำให้ใช้ลูกสวนขนาดเล็ก ซึ่งหาซื้อได้ง่ายตามร้านขายยาทั่วไป ควรระวังอย่าใช้ชนิดที่ปลาย ทำด้วยโลหะเพื่อกันมิให้เกิดรอยขีดข่วนบนผิวของเลนซ์ได้ วิธีเป่าฝุ่นออกโดยใช้ลมปากไม่ควรจะกระทำอย่างยิ่ง เพราะจะทำให้เกิดมีหยดน้ำลายเกาะเต็มผิวของเลนซ์หรือแก้วสะท้อนภาพเต็มไปหมด ซึ่งยากแก่การเอาออกในภายหลัง

ถ้าปรากฏว่าภาพที่เห็นในกล้องไม่ชัดเจนพอ ควรจะตรวจผิวของเลนซ์ส่วนปลายล่างด้วยแว่นขยาย ฝุ่นละอองที่เกาะเลนซ์หรือเลนซ์เกิดชำรุดขึ้นมาก็จะสังเกตเห็นได้ง่าย

เลนซ์ของ Objective ไม่ควรจะถอดแยกออกมาเป็นชิ้น ๆ เพราะได้ประกอบเข้ากันอย่างดีแล้วจากโรงงาน ยกเว้นชนิดที่ระบุว่าได้ถอดได้ ( ตัวอย่างเช่น ถอดเพื่อใส่แกนส่งภาพสำหรับใช้กับ Darkfield Condenser ) เลนซ์ทั้งหมดได้ตั้งระยะไว้ห่างกันพอดีแล้ว ถ้ามีการถอดก็ควรให้โรงงานที่มีเครื่องมือการตรวจการประกอบใหม่ทำให้

๔. Dry Objective, Condenser และ Eyepieces อาจจะทำความสะอาดได้ถ้าต้องการจะใช้น้ำ โดยใช้น้ำกลั่น ส่วน immersion Objective และเลนซ์ส่วนบนของ Condenser ต้องใช้ Xylene วิธีปฏิบัติก็คือใช้กระดาษเช็ดเลนซ์ที่สะอาดชุบน้ำกลั่น หรือ xylene แล้วแต่กรณี ในปริมาณที่น้อยที่สุดเช็ดซ้ำด้วยกระดาษเช็ดเลนซ์ใหม่ที่แห้งและสะอาดหลาย ๆ ครั้ง หัว immersion Objective ที่มีน้ำมันเกาะเกรอะกรังอยู่ต้องใช้กระดาษเช็ดเลนซ์ซุบ xylene เช็ออกโดยวิธีเดียวกัน มีข้อห้ามอยู่ว่าอย่าจุ่มเลนซ์ลงไปใน xylene หรือในน้ำยาอื่น ๆ การกระทำเช่นนี้จะทำให้รอยเชื่อม รอบ ๆเลนซ์ละลาย ของเหลวเหล่านี้จะซึมเข้าไปในตัว objective ได้

ในเขตที่มีอากาศร้อน ที่มีความชื้นสูงและอุณหภูมิสูงกว่า ๘๐ องศาฟาเรนไฮท์เชื้อราจะเจริญได้ดีบนเลนซ์ที่สกปรกโดยเฉพาะ วิธีป้องกันโดยรักษาเลนซ์ให้สะอาดเสมออย่าเก็บกล้องในที่ชื้น จะเก็บหัวกล้องไว้ใน dessicator ก็ได้ หรือจะเก็บกล้องไว้ในตู้ที่อุ่น

๕. โครงของกล้องส่วนใหญ่เคลือบด้วย enamel ทนทานต่อน้ำยาเคมีต่าง ๆ เมื่อสกปรกมีฝุ่นเกาะมากก็อาจจะทำความสะอาดได้โดยใช้ผงสบู่ธรรมดาและน้ำ

Fine adjustment ไม่ต้องหยอดน้ำมัน ฟันเลื่อยส่ง coarse adjustment เพื่อเลื่อน stage ขึ้นลงอาจจะใช้น้ำมันหล่อลื่นเล็กน้อยก็ได้ ถ้า coarse adjustment เกิดความฝืด

กล้องจุลทรรศน์เมื่อใช้ไม่ค่อยได้ดีเหมือนเดิม ตรวจแล้วไม่มีฝุ่นเกาะที่ Objective หรือ Eyepieces ควรสงสัยว่าแก้วสะท้อนภาพอาจจะเคลื่อน อย่าพยายามแต่งให้เข้าที่ด้วยตนเอง ควรให้ช่างผู้ชำนาญทำการซ่อม

การป้ายกระจกเพื่อตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์

การตรวจเชื้อจุลินทีรย์ ( Bacteria ) ชนิดใดชนิดหนึ่งก็ตาม จำเป็นต้องใช้วิธีป้ายให้เป็นแผ่นบาง ๆ บนกระจก ซึ่งอาจจะได้จากโลหิต หนองจากแผลหรือฝีเยื่อชุ่มหรืออุจจาระ ฯลฯ แล้วจึงย้อมสีด้วยวิธีต่าง ผลของการตรวจโดยการป้ายกระจก โดยตรวจดูจากกล้องจุลทรรศน์ อาจจะปรากฏดังนี้ คือ

๑. ไม่พบเชื้อจุลินทรีย์ การตรวจโดยการป้ายกระจกไม่จำเป็นเสมอไปที่จะต้องพบจุลินทรีย์ เพราะเชื้อบางชนิดเป็นการยากยิ่งที่จะตรวจพบได้

๒. พบเชื้อจุลินทรีย์อยู่บนแผ่นกระจกอย่างชัดเจน มีจุลินทรีย์หลายชนิด รวมทั้งโปรโตซัวโลหิต แต่ก็ไม่สามารถจะบอกได้ว่าเป็นชนิดใด เว้นไว้แต่เชื้อบางชนิดเท่านั้น เช่น เชื้อแอนแทรกซ์ ฉะนั้น จึงต้องอาศัยความชำนาญ

๓. พบเชื้อจุลินทรีย์หลายชนิดอยู่ปะปนกันในกระจกแผ่นเดียว ถ้าป้ายเชื้อจากเยื่อบุลำไส้ บาดแผล และหนองฝี เป็นต้น การพบจุลินทรีย์หลายชนิดปนกันก็เป็นการยากที่จะพิจารณาว่า จุลินทรีย์ใดเป็นโรค นอกจากจะใช้วิธีการอื่นตรวจประกอบด้วย การตรวจโดยการป้ายกระจกอาจจะตรวจจากวัตถุต่าง ๆ กัน คือ

การป้ายกระจกจากหนอง

หนองที่ใช้ในการตรวจนั้น ถ้าได้จากฝีที่เปิดใหม่จะดีกว่าป้ายจากหนองที่ไหลออกมา เพราะหนองที่ไหลออกมาจะมีจุลินทรีย์อื่นปน ตามปกติขนในบริเวณที่จะเปิดเอาหนองออกต้องตัดและขลิบ ล้างให้สะอาดด้วยแอลกอฮอล์ ใช้ขดลวดแพลทตินัม ( platinum loop ) ลนไฟ แล้วแตะหนองแต่เพียงเล็กน้อย ป้ายลงบนกระจกที่สะอาด ๆให้เป็นแผ่นบาง ๆ หรืออาจจะใช้แตะด้วยมีดผ่าตัดหรือใช้กระจกอีกแผ่นหนึ่งก็ได้

ในกรณีที่ต้องการจากแผล ต้องทำความสะอาดบาดแผลนั้นเสียก่อนด้วยน้ำและสบู่

การป้ายกระจกจากอวัยวะของสัตว์

การป้ายกระจกจากอวัยวะต่าง ๆ ที่สงสัยว่าเป็นโรคส่วนมากจากตับ ม้าม ซึ่งเป็นแหล่งที่มีเชื้อโรคอยู่ ควรจะกระทำเมื่อเปิดช่องท้องของสัตว์ที่ตายใหม่ ๆ ในระยะนี้จะไม่มีจุลินทรีย์อื่นปะปน เมื่อป้ายกระจกแล้วควรจะลนไฟ เพื่อให้อวัยวะติดกระจก